二维液相色谱法分析食品中维生素ADE的含量

仪器系统：

科诺美Leaps二维液相色谱系统

系统配置：

P60双三元梯度泵

A50C自动进样器

C10V2柱温箱（内置2个二位六通阀）

D10紫外检测器

本方案采用两个六通阀，一维和二维检测交替使用一个紫外检测器，在一张色谱图展现两个维度的分离情况。通过阀的切换，将一维色谱柱上VD切至捕集柱柱头，再通过二维泵反向洗脱至二维反相色谱柱，实现VD的净化与分离。具体流路连接方式及实验步骤见下图。

由于中心切割时一维流动相的甲醇比例较高，目标物在捕集柱上有“流穿”风险，因此本实验考察了捕集柱在切割过程中对VD的保留效果。具体如下操作：13.9 min后保持阀状态不变（左阀与右阀：1-2），右阀3号口连接另一紫外检测器，进样VD2/VD3混标溶液，图谱如下所示。由结果可知，两个检测器的峰间隔时间为2.5 min，因此在1 min的切割窗口内（13.9~14.9 min）VD仍保留在捕集柱上，中心切割效果较好。

按照上述方法，对混合标准品溶液进行分析，所得色谱图如下图所示。从结果中可以得到 VA、VD2、VD3、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE 得到了良好的分离。其中第一维色谱中 β-VE 和 γ-VE 的分离度为 1.66，VD2 与 VD3 分离度为 2.75，满足方法定量要求。基于本方案的阀配置，VD的一维可视峰信号可辅助判断因一维保留时间漂移对中心切割窗口的影响，使本方法在实际样品分析中更有应用价值。

· 线性范围、灵敏度、重复性

用甲醇配制ADE混合标准工作液（VA：100 μg/mL；α、β、γ、δ-VE：1000 μg/mL；VD2、VD3：1 μg/mL），再逐级稀释得到系列标准溶液。由于配方食品中VD添加量通常较低，而VA和VE含量较高且固定，本方案考察了VA在0.1~10 μg/ml、VE在1~100 μg/ml、VD在1~100 ng/mL浓度范围内的线性关系，以及重点考察了VD的仪器检出限。由结果可知，在进样量为100 μL条件下，所有化合物线性关系较好，相关系数>0.9999；VD2和VD3浓度为1 ng/mL时, S/N>3,按照称样量为5 g，定容体积10 mL估算，该方法的检出限为0.2 μg/100g，低于GB 5009.296-2023的方法检出限（0.6 μg/100g）

选取ADE混合标准溶液（VA：1 μg/mL；α、β、γ、δ-VE：10 μg/mL；VD2、VD3：10 ng/mL）重复进样六针（重叠图谱如下所示），考察化合物峰面积和保留时间的重复性。由结果可知，所有化合物保留时间RSD<0.1%,峰面积RSD<1%，表明该方法稳定性较好。

· 样品测试

准确称取某品牌婴儿配方奶粉5g，按照GB 5009.82-2016第一法制备样品，进样分析，样品图谱如下所示。由结果可知，本方案一次前处理，一针进样可实现维生素ADE的同时检测。经过反相二维液相色谱中心切割对VD进行净化和分离，降低基质干扰，能够准确对奶粉中低含量的VD进行定量。

本方案使用科诺美Leaps二维液相色谱系统，建立了食品中维生素ADE含量的分析方法。该方法使用反相二维液相色谱中心切割，避免了VD正相净化的繁琐步骤，且经过一次前处理，一针进样可实现维生素ADE的同时检测；使用科诺美P60双三元梯度泵配单检测器的方案让仪器配置更加精简，项目运行成本更低。经过初步方法学考察，该方案的线性范围、重复性、灵敏度满足国标要求，结果准确可靠，可作为快速分析食品基质中脂溶性维生素的有效手段。