Chromai TQ5000 UHPLC-MS/MS检测缬沙坦片中的亚硝胺类基因毒性杂质

缬沙坦是一种血管紧张素II受体阻滞剂（ARBs），用于治疗高血压和心力衰竭。2018年7月13日美国FDA发布通告，由于在某些缬沙坦药品中检测出一种潜在致癌物-N-二甲基亚硝胺（NDMA），因此需要召回市场上某些公司生产的缬沙坦产品。2019年FDA发布了ARBs药物中亚硝类基因毒性杂质的临时限量，对于最大剂量320 mg/day的缬沙坦原料药，NDMA和N-亚硝基二乙胺 (NDEA）的限量分别为0.3 ppm和0.083 ppm。

关于亚硝类基因毒性杂质的检测方法，FDA发布了GC/MS、GC/MS/MS以及LC-HRMS（液相色谱-高分辨质谱）的分析方法；对于沙坦类药物，欧洲药典委员的检测方法包括GC/MS、GC/MS/MS、HPLC-UV和LC/MS/MS的分析方法。三重四级杆液质联用仪使用多级反应监测（MRM）的数据采集方式，是痕量化合物定量的黄金法则，本方案使用Chromai TQ5000 UHPLC-MS/MS，搭配大气压化学电离源（APCI）建立了缬沙坦片中四种基因毒性杂质-NDMA、NDEA、N-nitrosoethylisopropylamine（NEIPA），N-nitrosodiisopropylamine（NDIPA）的检测方法。

图1亚硝胺结构通式

四种亚硝胺标品（NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA）使用前先用甲醇配制成浓度为1 mg/mL的独立储备液，再用甲醇稀释成10 µg/mL的混合标准溶液，最后使用10%甲醇水溶液连续稀释，得到系列线性标准溶液。

取缬沙坦片一粒（含API 80 mg），准确加入8.0 mL 10%甲醇水溶液（API浓度10 mg/mL），超声提取10 min，12000 rpm离心5 min，上清液过0.22 µm滤膜，最后取20 µL滤液上机测试。

LC系统：科诺美 Frontier UHPLC

色谱柱：Lotus UHPLC C18色谱柱，2.7 µm, 3.0 mm × 100 mm

柱温：40 ˚C

流速：0.6 mL/min

流动相A：0.1%甲酸

流动相B：甲醇

质谱系统：Chromai TQ5000

电离模式：APCI (+)

喷雾电压：4000 v

离子源温度：400℃

雾化气：20 psi

气帘气：40 psi

*表示定量离子

LC/MS/MS方法优化

本文考查了流动相组分（0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸+2mM甲酸铵-甲醇）对色谱分离和质谱响应的影响，结果表明0.1%甲酸-甲醇的流动相体系可获得较好的色谱峰型和质谱灵敏度。此外，样品溶剂中的有机相比例不宜过高，否则会影响NDMA的峰型和灵敏度。相同色谱条件下，10mg/mL API的液相色谱图如图2所示，在NDIPA出峰之后，API出峰之前将流路设置为“引入废液”，并采用高比例有机相充分洗脱API，避免污染质谱系统。

在优化后的条件下，四种亚硝胺之间及杂质与API之间分离良好，0.5 ng/mL标液的提取离子流图如图3所示，由结果可知，该浓度下四种亚硝胺杂质灵敏度较好，S/N（ptp）均大于10。

图2 10 mg/mL缬沙坦液相色谱图

图3 0.5 ng/mL标准溶液提取离子流图

在0.5-100 ng/mL的浓度范围内，四种亚硝胺化合物线性关系良好，相关系数R2>0.999（如图4）；选择1 ng/mL和100 ng/mL两个浓度点，重复进样6针，峰面积和保留时间的重复性如表1和表2所示。

本方法的标准溶液的定量限可到0.5 ng/mL，在样品配制浓度为10 mg/mL的情况下，该方法定量限为0.05 ppm，满足FDA的限量要求。

图4 四种亚硝胺化合物标准曲线

表1 混标1 ng/mL保留时间和峰面积重复性

表2 混标100 ng/mL保留时间和峰面积重复性

在样品中加入四种基因毒性杂质混标，控制其在最终溶液中的浓度为1、20、50ng/mL，即相对于API加标浓度为0.1、2、5 ppm，其余步骤按前述样品制备完成。

由结果可知，三个加标水平均在90%-105%之间（表3）。

表3 回收率结果

加标样品重复进样50针，考查仪器的系统压力、目标物保留时间与峰面积的稳定性，结果如图5所示。

由结果可知，在多次进样高浓度的API溶液情况下，系统压力曲线基本重合，目标物的分离和响应稳定。

图5 方法耐用性考查

本文采用配备APCI源的Chromai TQ5000三重四极杆液质联用系统，同时检测缬沙坦片中四种亚硝胺类化合物，由于搭配科诺美Frontier UHPLC超高效液相色谱，分析时间仅为10 min，且方法重现性好，灵敏度满足目前FDA规定的限量要求。另外，通过质谱切换阀将高浓度样品基质引入废液而不引入离子源，可减少对质谱系统的污染，从而提高方法的耐用性。该方法适用于对沙坦类原料药和部分制剂中的四种亚硝胺类基因毒性杂质进行快速筛查和准确的定量分析。