二维液相色谱-质谱联用分析阿莫西林中杂质
阿莫西林（Amoxicillin）又称羟氨苄青霉素，CAS No. 26787-78-0，是一种常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，在高温、光照、酸、碱和氧化等条件下不稳定。临床上证实阿莫西林的聚合物会引起过敏反应，所以在生产和贮存过程中产生的有关物质，直接影响产品质量和临床用药的安全性。
在《中国药典》2020 版中分析阿莫西林有关物质时，采用高效液相色谱紫外检测器法，流动相为磷酸二氢钾溶液和乙腈。由于流动相中含有不挥发性磷酸盐，该方法不能直接进行质谱分析。因此，本方法采用在线柱切换二维液相色谱，将一维目标杂质峰通过阀切换转入二维色谱柱，并进行在线脱盐，然后采用质谱兼容的流动相，实现质谱定性分析。
图1 阿莫西林结构式（MW 365.4）
仪器系统：
Chromai二维液相色谱系统（双三元泵P60、自动进样器A10C、标配两个二位六通阀柱温箱C10V2、紫外检测器D10）
Chromai三重四级杆质谱仪（TQ5000）
图2 Chromai液相色谱-质谱联用仪（TQ5000）
液相色谱条件：
一维色谱柱：Lotus ACC4 4.6×250 mm, 5 μm
二维色谱柱：Lotus AQ-C18 4.6×250 mm, 5 μm
一维流动相A：[0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（2 mol/L氢氧化钾调节pH 至 5.0）]：乙腈=99：1
一维流动相B：[0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（2 mol/L 氢氧化钾调节pH 至 5.0）]：乙腈=80：20
二维流动相A：0.1%甲酸水
二维流动相B：乙腈
柱温：35 ˚C
流速：1.0 mL/min
Loop环体积：1000 µL
进样体积：50 µL
检测波长：254 nm
质谱参数：
电离源：ESI源
扫描模式：
Q1全扫描：正离子模式，m/z: 200-1200
负离子模式，m/z: 80-500
子离子扫描：m/z: 100-400，标准分辨率，CE 10 V，CAD 8
离子源温度：550 ℃
辅助加热气：50 psi
雾化气：40 psi
气帘气：40 psi
样品前处理：
称取阿莫西林20.0 mg，加入一维流动相A超声溶解并定容至10.0 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，待分析。
结果与讨论：
阿莫西林杂质在一维及二维色谱的保留时间见表1，分析时将一维色谱中目标峰收集到Loop环中，再次切阀把目标峰转移至二维色谱柱中，0-10min切至废液实现在线脱盐，10.1min开始切入质谱进行定性分析（见图3）。
表1 二维液相保留时间和柱温箱六通阀切阀时间
|
一维色谱峰峰号 |
2 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
一维保留 时间/min |
7.742 |
25.842 |
28.905 |
30.946 |
33.545 |
34.259 |
|
二维保留 时间/min |
12.345 |
12.427 |
12.544 |
14.043 |
13.662 |
13.767 |
图3 二维液相色谱质谱联用示意图
色谱图
如图4所示，一维色谱图中1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12号峰为杂质峰，3号峰为阿莫西林主成分。
图4 二维液相色谱中一维色谱图
质谱图
杂质在质谱上的母离子与特征碎片离子分别如下图所示，根据碎片离子与参考文献，可初步推测鉴定阿莫西林中各杂质成分。
图5 各编号杂质峰提取离子流图（提取偏差0.5）
图6 2号峰子离子扫描特征离子谱图
图7 5号峰子离子扫描特征离子谱图
图8 6号峰子离子扫描特征离子谱图
图9 7号峰子离子扫描特征离子谱图
图10 8号峰子离子扫描特征离子谱图
图11 9号峰子离子扫描特征离子谱图
表2 各编号杂质峰全扫描与子离子扫描结果汇总
|
色谱峰编号 |
正离子全扫描m/z |
子离子碎片m/z |
负离子全扫描m/z |
|
2 |
384.35 |
367.85 323.80 229.60 189.55 |
382.25、338.20 |
|
5 |
340.25 |
323.70 229.35 189.25 |
338.20 |
|
6 |
340.25 |
323.70 229.50 189.45 |
338.30 |
|
7 |
366.30 |
207.50 160.45 |
364.25、410.25 |
|
8 |
366.25、731.50 |
396.95 366.85 339.65 311.85 160.25 |
729.35 |
|
9 |
366.45、731.60 |
396.95 366.90 339.70 311.80 160.30 |
729.55 |
根据表2结果，通过与文献对比，推测如下：2号峰杂质可能为amoxicilloic acid (5S,6R)或amoxicilloic acid (5R,6R) [1, 2]；5号峰与6号峰具有一致的质谱碎片，应互为同分异构体，可能为amoxilloic acid (5S)或amoxilloic acid (5R) [1, 2]；7号峰与阿莫西林主成分具有一致的质荷比，应互为同分异构体，可能为L-amoxicillin, amoxicillin (5R) piperazine-2′,5′-dione或amoxicillin (5S) piperazine-2′,5′-dione [1, 2]；8号峰与9号峰具有一致的质荷比，且质谱碎片基本一致，推测该杂质为阿莫西林二聚体[2]。
结论
本方案使用科诺美特色的双三元泵，采用在线柱切换二维液相与质谱联用的方式，可以对一维色谱分析洗脱出来的目标化合物，通过阀切换转移至Loop环，然后通过另一个泵把Loop环中的洗脱液转移至二维色谱柱上，实现在线脱盐后，立即进行质谱分析。该方法可以快速地对阿莫西林中6 个微量目标杂质进行定性分析，并通过二级质谱的裂解分析，实现相关的结构鉴定，为阿莫西林原料药进行质量控制提供参考。
参考文献
[1]NäGELE E, MORITZ R. Structure elucidation of degradation products of the antibiotic amoxicillin with ion trap MS
and accurate mass determination by ESI TOF [J]. J Am Soc Mass Spectr, 2005, 16(10): 1670-6.
[2]VALVO L, CIRANNI E, ALIMENTI R, et al. Development of a simple liquid chromatographic method with UV and mass spectrometric detection for the separation of substances related to amoxicillin sodium [J]. J Chromatogr A, 1998, 797(1-2): 311-6.
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